产品描述

HRbio™ qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 是 2×实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动 HRbio™ DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg²⁺。使用时仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量 PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

本品采用的 DNA 聚合酶配体可以随温度变化实时调节 DNA 聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性 PCR 扩增的因子和提升 PCR 反应扩增效率的因子，使定量 PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

适用机型

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料 SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

• 推荐使用本公司 cDNA 合成试剂盒，以有效去除 RNA样品中残留的基因组。
• 解冻后 Master Mix 可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
• 本产品仅作科研用途！

引物设计指南

1. 推荐引物长度25 bp 左右。扩增产物长度 150 bp 为佳，可以在 100 bp-300 bp 内选择。

2. 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过 2℃。引物 Tm 值 60℃-65℃为佳。

3. 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的 4 个相同碱基，GC 含量控制在 50%左右。3’端最后一个碱基最好为 G 或 C。

4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有 3 个碱基以上的互补序列。

5. 引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物 3’端有 2 个碱基以上的非特异性互补。

6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

实验案例

产品信息

反应体系（推荐冰上配制）

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在 0.1-1.0 μM 之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。

c) 模板稀释：cDNA 原液建议 5-10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 CT 值在 20-30 个循环为好。

d) 反应体系：推荐使用20 μL 或 50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

扩增程序（两步法）

扩增程序（三步法）

【注】高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a) 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至 2 min。

b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec 以上： Applied Biosystems: 7300
34sec 以上： Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1）扩增曲线：
标准扩增曲线为 S 型。
Ct 值落在 20-30 之间时，定量分析最准确；
Ct 值小于 10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
Ct 值介于 30-35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2）熔解曲线：
熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。熔解曲线出现双峰，需要通过 DNA 琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。
如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。